www.eprace.edu.pl » ekstruzja » Wstęp

Wstęp

W dobie dużej konkurencji na rynku, celem producenta żywności jest dążenie do uzyskania w produkcie jak najwyższej jakości jak najmniejszym nakładem. Jednakże, do tej jakości można mieć zastrzeżenia. Zapomina się o zaufaniu, jakim obdarza nas klient, który decyduje się na zakup danego produktu. Fałszowanie żywności nie jest obcym zjawiskiem w technologii żywności, zwłaszcza należy pamiętać, że taka niezgodność składu produktu z recepturą podaną na etykiecie jest zwykłym przestępstwem (Calvo i In. 2001). Jest dużo powodów dzięki którym, wyroby przetworzone, które mają w swoim składzie mięso powinny być kontrolowane. Przynależność religijna, w różnych regionach świata żyją duże grupy ludności, które ze względu na swoje wyznanie odrzucają spożywanie mięsa wieprzowego (muzułmanie, Żydzi) lub mięsa wołowego (Hindusi). Względy zdrowotne, chociaż stosunkowo rzadko, istnieją jednak alergie na białko określonych gatunków zwierząt, tak więc dla osób uczulonych na dany rodzaj białka ma to ogromne znaczenie; oraz względy prawne weryfikacja roszczeń płacowych w przypadku eksportu mięsa na obszarze Unii Europejskiej zakłada możliwość strzeżenia specyfikacji deklarowanego gatunku i wykrycia ewentualnej domieszki mięsa innego gatunku;(a Anonim 1998)

Dokładne analizy metody są nie zbędne do sprawdzenia deklarowanej etykiety w produktach mięsnych i zawierających jego dodatek i dlatego potrzeba prostej i szybkiej procedury postępowania izolacji i identyfikacji. Białko mięsa i DNA jest używane do specyfikacji gatunków mięs. W metodach analitycznych wykorzystuje się białko mięsa poprzez zastosowanie takich metod jak; SDS-PAGE - sodum laury sulfate polyacryloamide, gel electrophoresis) (Craig 1995), HPLC – chromatografia cienkowarstwowa, IEF-isoelectro focusing (Hsieh 1997), lub za pomocą testów immunologicznych (ELISA, immunodyfuzji), Słomski 1998). Jednakże, obecność i stan białek jest zależna od postaci tkanki i przetworzenia białek mięsa w czasie procesów technologicznych, mogą one zmieniać strukturę i stabilność, może to powstrzymać identyfikację białka (Calvo i In. 2001). Alternatywą jest analiza DNA, która tworzy atrakcyjną strategię dla identyfikacji w porównaniu z metodami bazującymi na białku, ponieważ DNA jest stabilniejsze na przetwarzanie w czasie obróbki technologicznej żywności.(Martinez i In. 1998).

Po tym jak od 1 lipca 2003 roku w Niemczech w znakowaniu żywności wprowadzono „ilościową deklaracje składników” (Quiz) obowiązującą, także w przypadku produktów mięsnych, stosowanie metody real-time PCR (reakcja polimerazy łańcuchowej), jest coraz bardziej propagowana w celu identyfikacji gatunków mięsa. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) przebiega na bazie DNA stanowi bardziej czułą metodę utożsamiania gatunków mięsa zawartych w produktach mięsnych niż inne metody, w których wykrywa się obecność specyficznych białek i związków zawartych w tłuszczach mięsa różnych zwierząt, (b Anonim 2004).

Łańcuchowa reakcja polimerazy jest metodą syntezy in vitro wybranej sekwencji DNA, polegała na wielorazowym zazwyczaj 30-40 razy powtarzaniu trzyetapowego cyklu, (Janek 1996). W jednej próbówce reakcyjnej umieszcza się oprócz matrycy badanego DNA, wyizolowanej z materiału badanego, także następujące komponenty: primery (startery) - krótkie, sztucznie syntezowanie oligonukleotydy, od których zaczyna się amplifikowaną sekwencję DNA, polimerazy DNA - enzym budujący nowe komplementarne do matrycy nici DNA, oraz nukleotydy – wbudowywane w nowo powstająca nić DNA, (Nawrotek 1998). Całość umieszcza się w termocyklerze, w którym cyklicznie zależnie od zaprogramowanego profilu termicznego reakcji PCR, odbywa się denaturacja przy 90-95ºC przez 30-60 sekund, hybrydyzacja w 50-65ºC przez 30-60 sekund, a elongacja 68-72ºC przez 60-120 sekund, (Słomski 1998). Po podgrzaniu roztworu reakcyjnego następuje rozkręcenie podwójnej nici DNA, (denaturacja) następnie startery komplementarnie wiążą się (hybrydyzacja) z odpowiednimi fragmentami pojedynczej nici DNA wskazując w ten sposób polimerazie miejsce, w którym ma rozpocząć syntezę nowej komplementarnej nici. Ta synteza polega na dobudowaniu do starterów kolejnych nukleotydów i wydłużaniu powstającej nici (elongacja) wzdłuż matrycy DNA w sposób komplementarny do niej. W efekcie powstaje nowy, dwuniciowy fragment DNA będący precyzyjną kopią matrycy użytej do reakcji. Kolejna cykliczna, termiczna denaturacja podwójnej nici DNA, ponowna hybrydyzacja starterów do matrycy oraz wydłużanie daje w rezultacie amplifikacje następnego segmentu DNA, stanowiącego kopię DNA wyjściowego. Każdy cykl podwaja liczbę fragmentów DNA, zsyntetyzowanych w poprzednim, zwielokrotniając go w sposób wykładniczy, stąd łatwo to obliczyć, że po 32 cyklach reakcji liczba matryc wyniesie 232=1,073,741,824 (Tabela 1).Obecnie metoda PCR, jak i jej liczne odmiany jest rutynowa i używana w pracowniach biologii molekularnej na całym świecie, (Nawrotek 1998).Przykłady zastosowań PCR można podzielić na dwie grupy. Pierwsza, obejmuje klasyczną metodę i jej modyfikacje, które odnalazły zastosowanie jako nowe techniki badawcze – metoda zdegenerowanych primerów, zakotwiczona PCR, sekwencjonowanie DNA, przygotowanie sond molekularnych. Drugi obszar działań PCR to wykorzystanie tej metody w celach diagnostycznych, w diagnostyce chorób genetycznych i chorób o podłożu zakaźnym, (Kużmiak 1993).

W przypadku PCR istnieje możliwość używania niezwykle małych ilości analizowanego produktu (mięsa, przetworów).Najważniejszym zastosowaniem PCR jest uzyskanie zwiększonej ilości fragmentu DNA, w którym występuje mutacja lub polimorfizm, a następnie dalsza analiza z wykorzystaniem innych metod takich jak: PCR-RFLP (ang. restriction fragment length polymophism), RAPD (ang. random ampification of polymorphic DNA) lub technik elektroforetycznych, PCR-HD (analiza hetrodupleksów), PCR-SSCP (ang. single strand conformation polymorphisms, (Roberts 1989), (Martinez i in. 1998).

Powstały również warianty PCR umożliwiające rozróżnienie alleli badanego fragmentu. W metodzie ASA-PCR (ang. Allele Specific Amplification) startery do reakcji charakteryzują się specyficznością dla DNA typu dzikiego lub zmutowanego, co pozwala na selektywną amplifikację określonego allelu. Z kolei w metodzie ASO-PCR amplifikuje się wszystkie allele, a ich rozróżnienie odbywa poprzez hybrydyzacje sond specyficznych dla alleli z produktem PCR. Metoda PCR dała również początek kilku wariantom umożliwiającym amplifikacje fragmentom o nieznanej sekwencji, (Słomski 1998). Przykładem może być tzw. odwrócona PCR (ang. inverted PCR), w której badany fragment DNA łączy się z fragmentem znanym lub klonowanym w wektor, a startery są specyficzne dla znanego odcinka DNA. Innym wariantem jest wewnętrzny PCR (nested PCR),w którym korzysta się z dwóch par starterów, przy czym druga para umieszczona jest wewnętrznie stosunku do pierwszej pary, (Kamolvarin 1993). Po amplifikacji z pierwszej pary starterów, w której celem jest zamplifikowanie dużych fragmentów (1000-2000pz.), prowadzi się drugą amplifikację znacznie mniejszych fragmentów, wskutek czego można podnieść specyficzność reakcji przy jednoczesnym wyeliminowaniu fragmentów niespecyficznych. Technologie oparte na metodzie PCR można podzielić na bardzo czułe i specyficzne oraz takie, które określa się mianem przesiewowych, np. PCR-SSCP(analiza polimorfizmu pojedynczoniciowych fragmentów DNA), (Orita 1998) PCR-HD (analiza hetrodupleksów), PCR-DGGE (analiza elektroforetyczna w gradiencie czynnika denaturującego), (Smith-Sorensen 1993), (Słomski 1998).

Granica wykrywalności dla danego gatunku wynosi w zależności od zastosowanej metody, PCR 0,1 % lub nieco mniej, podczas gdy w przypadku innych wymienionych metod wynosi ona około 1% (lub więcej), (b Anonim 2004). Dokładne analizy metody są nie zbędne do skontrolowania deklarowanego składu w produktach mięsnych i zawierających jego dodatek i dlatego potrzeba prostej i szybkiej procedury postępowania izolacji i identyfikacji, (Matsunaga i In. 1999).

Wzrost zainteresowania racjonalnym żywieniem wpływa między innymi na wzrost zainteresowania preparowanymi produktami żywnościowymi. Trudności identyfikacji składników produktów żywnościowych wzrastają wraz ze stopniem jego przetworzenia. Artykuły żywnościowe powstające dzięki metodzie ekstruzji, znane są od kilkudziesięciu lat i dynamicznie podbijają rynki żywnościowe Polski.

Krytycznymi punktami produkcji, ekstrudatów, które mogłyby wpłynąć na zwyrodnienie DNA, a przez to brak identyfikacji składu surowcowego są nimi następujące etapy:



Podrozdzialy w tym rozdziale:


Opis ekstruzji


komentarze

Copyright © 2008-2010 EPrace oraz autorzy prac.