Metody wykorzystane do analiz
Izolacja DNA metodą Genomic Mini AX Food
Izolacja DNA z ekstrudatów zbożowych metodą Genomic Mini AX Food
- Firmy HELIOCONIUS- A&A Biotechnology wg protokołu.
Na tym etapie komórki powinny zostać poddane lizie, a uwolniony w trakcie rozpadu materiał genetyczny oczyszczeniu z pozostałości białkowych. Rozcierano próbę, aby była sypka(postać mąki), do próbówki 2ml dodano 10 mg naważki przygotowanej próby. Następnie dodano roztwór lizujący, oraz 20ųl proteazy. Wymieszano dokładnie, a następnie inkubowano w temperaturze 55 ºC przez 60-120 minut, do całkowitego rozpuszczenia. Dodano 2ųl RNA-azy (10mg/ml, RNA-za Sigma Gdańsk), a następnie całość wymieszano i inkubowano 5 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji próbę intensywnie worteksowano przez 15 sekund, a następnie wirowano przez 5 minut przy 12 tyś. obrotów na minutę. Pobrano supernatant i naniesiono na kolumnę umieszczoną w próbówce 15 ml, odczekano aż lizat przejdzie przez kolumnę(kolumna pracuje grawitacyjnie). Płukano kolumnę przez dodawanie 1.5 ml roztworu płuczącego K2. Czekając aż roztwór całkowicie wypłynie z kolumny, czynność tą powtórzono. Dodano do kolumny 0.25 ml roztworu elucyjnego oraz odczekano aż wypłynie z kolumny. Krok ten miał na celu zmniejszenie całkowitej objętości eluatu, gdyż martwa objętość kolumny wynosi 0.3 ml. Przeniesiono kolumnę do ependorfów znajdujących się w zestawie i dodano 1 ml roztworu elucyjnego. Następnie aplikowano do eluatu zawierającego DNA 800 ųl izopropanolu, całość mieszano i wirowano 10 minut przy minimum 12 tyś. obrotów na minutę. Po odwirowaniu zlano supernatant (na dnie powinno być widoczne DNA), dodano 500 ųl 70% etanolu. Próbkę mieszano i wirowano 3 minuty przy minimum 12 tyś obrotów na minutę. Po wirowaniu zlano supernatant, a osad osuszono poprzez odwrócenie próbówki 10 minut w temperaturze pokojowej, używano kapilar. Dodano po osuszeniu 50 ųl buforu TE i przechowywano DNA w temp. 4 ºC
.
Reakcja PCR
Procedurę projektowania primerów, wykonał mgr. W. Sawicki. PCR standardowo prowadzony w próbówce typu Eppendorff o poj.0,5 ml. W objętości mieszaniny reakcyjnej, znajduje się roztwór primerów SIM niespecyficzny, który był wspólny dla wszystkich prób, oraz primery specyficzne (zsyntetyzowane przez firmę TIB MOLBIOL Poznań) dla każdego gatunku mięsa inne;(Tabela 4). Fosforany dezoksorybonukleozydów (dNPT), MgCl2, Taq polimerazy z buforem, oraz matryca DNA. Trzydzieści sześć cykli było prowadzonych w Mastercyler gradient, (Eppendorf AG Hamburg), które przebiegały w trzech etapach denaturacja 94 ºC-30, hybrydyzacja 60 ºC -30 s., elongacja 75 ºC-30s.
Wykrywanie produktÓw reakcji PCR
Produkty amplifikacji wykrywaliśmy przy zastosowaniu technik elektroforetycznych na aparacie poziomym firmy Bio-Rad Sub-Cell-GT, aparat podłączyliśmy do zasilacza Thunder przy napięciu 60 V – czas 1.5 h. Do rozdziału amplifikowanego materiału wykorzystano żel agarozowy 2% sporządzony poprzez rozpuszczenie 0,8 g agarozy (Prona Agararose Plus, UE) w 40 ml 1 x stężonym buforze TBE, oraz użyto bromku etydyny (10mg/ml, Bio-Rad, USA),który daje kompleksy z DNA i umożliwia obserwacje produktów w świetle UV, za skale par zasad służył nam marker DNA GDAŃSK 100-500. Zaletą elektroforetycznego rozdziału DNA na żelu agarozowym jest jego łatwe użycie i szybkie wykonanie, a także możliwość bezpośredniej identyfikacji produktów reakcji PCR, poprzez ich znakowanie fluoroforami takimi jak bromek etydyny, (Bryszewska i In.2000).Kwasy nukleinowe dzięki grupom fosforanowym mają ładunek ujemny, dlatego w polu elektrycznym wędrują w kierunku elektrody dodatniej. Szybkość wędrówki uwarunkowana jest wielkością i kształtem cząsteczki. Fragmenty o większej ilości par zasad poruszają się wolniej w polu agarozowym, wybarwionym bromkiem etydyny. Bromek etydyny daje kompleksy z DNA i umożliwia obserwacja produktów w świetle UV. Produkty amplifikacji widoczne, są w postaci, charakterystycznych pojedynczych prążków,(Mędrala 2003).
Identyfikacja produktu reakcji PCR
Identyfikacją elektroforezy była sprawdzenie rozdziału produktów uzyskanych w reakcji PCR na żelu agarozowym w postaci amplifikantów w świetle ultrafioletowym Gel Doc 2000 (Bio-Rad,USA) produkty amplifikacji, są widoczne w postaci intensywnych, pojedynczych prążków. Ocena produktów reakcji za pomocą oprogramowania Quantity One(Bio-Rad,USA).
komentarze
Copyright © 2008-2010 EPrace oraz autorzy prac.